Initiering och terminering av DNA-replikation i eukaryota celler Den eukaryota replikations-gaffeln DNA-helikaset: CMG helikaset -består av tre delar: MCM, Gins och Cdc45 Det enkelsträngsbindande proteinet: Replication protein A (RPA) Den eukaryota replikations-gaffeln DNA polymeraset på leading strand: DNA-polymeras epsilon • 3’ to 5’ exonukleas aktivitet (proof-reading) • Arbetar tillsammans med clamp (PCNA) DNA polymeraset på lagging strand: DNA-polymeras delta • 3’ to 5’ exonukleas (proof- reading) • Arbetar tillsammans med clamp (PCNA) Sliding clamp: PCNA Primaset finns inte med på bilden! I eukaryota celler är primaset ett kombi- enzym: DNA-polymeras alfa-primas • Startar DNA replikation på både leading och lagging strand, men lämnar sedan. • Har både primas aktivitet och DNA polymeras-aktivitet • Syntetiserar en kort RNA-primer och sedan 20 nt DNA. • Sedan ersätts DNA pol alfa-primas av antingen DNA pol epsilon eller DNA pol delta DNA-polymeras alfa-primas PCNA Sliding clamp – ökar processiviteten hos DNA-polymeras delta och epsilon, genom att förhindra att de lämnar DNA- templatet. Sitter som en ring runt DNA. Fjärlisexantem En autoimmun sjukdom med antikroppar mot antigener i cellkärnan (ANA – antinukleära antikroppar). Antikroppar mot PCNA är mycket vanligt vid SLE . Cellcykeln DNA-replikation sker endast i S-fas Allt DNA replikeras en gång i varje cell-cykel. DNA-replikation startar från origins of replication. • Humana genomet är 3 x 109 bp • 30 000 origins • Avstånd mellan origins är 50 – 300 kb Origin recognition complex • Binder till eukaryota origins of replication • Ett komplex som består av 6 proteiner som sitter bundna till origin under hela cellcyklen. Hur påbörjas DNA replikation? Två rekryterings faktorer hjälper ORC att locka till sig DNA helikaset MCM. • ORC är bundet till origin genom hela cellcykeln • Vid aktivering rekryteras först två laddningsfaktorer (Cdc6 och Cdt1) till ORC. • Cdc6, Cdt1 och ORC laddar sedan MCM-helikaset på DNA i en ATP-beroende process. • Laddning av MCM sker i G1 Reglering av initiering under cellcykeln (1). • CDK är proteinkinaser som reglerar cellcykelns progression. • I S-fas stiger mängden av cyklin- beroende kinas (CDK). • CDK stimulerar laddning av Cdc45 och GINS på MCM. De tre proteinerna bildar tillsammans. bildar det CMG-helikaset. Cdc45 och Gins laddas, MCM-helikastet aktiveras Reglering av initiering under cellcykeln (2). • CMG-helikaset smälter DNA vid origin of replication. • DNA polymeras alfa-primas laddas och kan starta bidirektionell replikation. • Viktigt att separera laddningen av MCM- helikaset från dess aktivering! På det viset säkerställs att DNA-replikation endast initieras en gång under cell- cykeln. Problem vid DNA-replikation Hur kan ändarna på linjärt DNA replikeras? Vi måste ju ha en RNA-primer? Detta är ett klassiskt problem. reverse Ändarna på kromosomer kallas telomerer! Dessa blir allt kortare med tiden i de flesta av vår kropps celler. När de försvinner dör cellen! Celler kan därför bara dela sig ett visst antal gånger! Gäller inte cancerceller och stamceller, som kan fortsätta dela på sig och deras telomerer förkortas inte! Hur går det till? Det finns s.k. ”omvänt transkriptas” – enzymer som kan syntetisera DNA med RNA som mall. Enzymet telomeras förlänger kromosomändar. Sker genom att lägga till en kort, repeterad sekvens på 6 nt. Enzymet Telomeras är ett omvänt transkriptas. Har med sig en egen RNA molekyl som den använder som mall för att syntetisera en kort DNA sträcka om och om igen. Aktivt telomeras finns t.ex. i stamceller och i cancerceller.