Johans Anteckningar

Slides

Att utforska proteiner

Sahlgrenska Akademin – LPG001 Biokemi – 2025-11-17
Linda Johansson, Ph.D. – linda.johansson.4@gu.se

Innehåll

  • Begreppet ”proteom”
  • Skillnader i proteiners kemiska och fysikaliska egenskaper och hur dessa ligger till grund för olika reningsprinciper:
    • gelfiltrering
    • jonbyteskromatografi
    • affinitetskromatografi
  • Principer och tillämpning av elektrofores (SDS-PAGE)
  • Översiktlig beskrivning av proteinanalys med immunologiska tekniker och ”blottning”
    • antikroppar och antigen
    • skillnad mellan monoklonala och polyklonala antikroppar
    • principen för ELISA
    • kliniska exempel
  • Masspektrometri – introduktion
  • Förutsättningar för proteinstrukturbestämning med:
    • röntgenkristallografi
    • NMR
    • kryo-EM
      och deras medicinska applikationer

Varför studera proteiner?

  • Forskning:
    • strukturbiologi – hur proteiner ser ut
    • biokemi – vad de binder
    • var de finns i kroppen
    • hur de påverkar sjukdomar
  • Klinik:
    • HIV-test (antikroppar, ELISA)
    • COVID-19 (antigen, antikropp, ELISA)
    • Myelom (detektion av IgM med proteinelektrofores)

Proteiner

  • Proteiner utför viktiga funktioner i de flesta biologiska processer, t.ex. DNA-replikation och signalöverföring.
  • Sensoriska funktioner som smak, lukt, temperatur och beröring bygger på proteiner.
  • Aminosyrasekvensen bestämmer konformationen (3D-strukturen) och därmed funktionen.

Proteiner – 2024 års Nobelpris

  • Handlar om proteiners strukturer och hur de kan designas och förutsägas.
  • David Baker: byggt helt nya proteiner.
  • Demis Hassabis & John Jumper: AI-modellen AlphaFold som löser strukturföre­spådningsproblemet.

Genom vs proteom

  • Genom: komplett DNA-sekvens (~3 miljarder baser, ca 23 000 gener).
  • Proteom: de proteiner som uttrycks av en cell vid en given tidpunkt.
  • Proteomet påverkas av:
    • celltyp
    • tidpunkt
    • proteininteraktioner
    • posttranslationella modifieringar
  • Proteomet är mycket dynamiskt och komplext.

Hur kan vi studera proteiner?

  • Vi behöver rena fram ett specifikt protein ur cellens innehåll.
  • Proteiner skiljer sig i:
    • storlek
    • laddning
    • löslighet
    • bindningsaffinitet
  • Egenskaperna används i reningsmetoder.

Preparation av protein – homogenisat

  • Celler bryts upp → homogenisat.
  • Centrifugering separerar komponenter:
    • pellet: i botten
    • supernatant: ovanför

Kromatografi – princip

  • Små kulor/beads med definierade egenskaper packas i en kolonn (fast fas).
  • Buffert + prov rör sig genom kolonnen (mobil fas).
  • Olika typer används beroende på proteinets egenskaper.

Gelfiltrering – separation efter storlek

  • Porösa kulor släpper in små molekyler men inte stora.
  • Stora proteiner kommer ut först.

Jonbyteskromatografi – separation efter laddning

  • Proteinets totala laddning styr bindning.
  • Anjonbytare: binder negativa grupper.
  • Katjonbytare: binder positiva grupper.
  • Eluering sker med pH-ändring eller saltgradient.

Affinitetskromatografi – separation efter selektivitet

  • Specifik bindning mellan protein och ligand.
  • Exempel: 6×His-tag → stark bindning till Ni²⁺-kolonn.
  • Eluering ofta med imidazol.

Analys av proteinrening

  • Flera reningssteg kombineras.
  • Man följer renheten vid varje steg.
  • Val av metod beror på:
    • önskad renhet
    • proteinets egenskaper

Gelelektrofores – princip

  • Molekyler med nettoladdning vandrar i elektriskt fält.
  • Polyakrylamidgel separerar efter storlek.
  • Små proteiner rör sig snabbare.

SDS-PAGE

  • SDS ger uniform negativ laddning proportionell mot massa.
  • Separation sker enbart på storlek.
  • Efter körning färgas gelen (Coomassie blue).

SDS-PAGE i reningskontroll

  • Prover tas efter varje reningssteg.
  • Rätt band ska bli tydligare och renare för varje steg.

Gelfiltrering vs SDS-PAGE

  • Gelfiltrering: störst först, används för rening.
  • SDS-PAGE: minst först, används för analys.

Antikroppar och antigen

  • Antikroppar → proteiner som känner igen antigen.
  • Del av antigenet som känns igen = epitop.

Monoklonala vs polyklonala antikroppar

  • Monoklonala: känner igen exakt samma epitop.
  • Polyklonala: mix som känner igen flera epitoper på samma antigen.

ELISA – princip

  • Enzymbundet antikroppssystem som ger färg vid substrattillsats.
  • Två huvudtyper:
    • Indirekt ELISA: detekterar antikroppar (t.ex. HIV)
    • Sandwich ELISA: detekterar antigen (t.ex. COVID-19)

Western Blot

  • SDS-PAGE → proteiner förs över till membran.
  • Inkuberas med primär + sekundär antikropp.
  • Signal mäts via enzym eller fluorescens.

Masspektrometri – princip

  • Identifierar peptider/proteiner.
  • Möjliggör analys av posttranslationella modifieringar.
  • Peptider joniseras → accelereras → separeras efter massa (t.ex. MALDI-TOF).

Masspektrometri – användning

  • Identifiera proteiner
  • Verifiera rening
  • Kartlägga PTM
  • Analysera sekvens och evolutionärt ursprung

Proteiners 3D-struktur

  • Bestäms av aminosyrasekvens.
  • Experimentella metoder krävs ofta trots AI-prediktioner som AlphaFold.
  • Struktur är centralt för läkemedelsutveckling.

NMR

  • Baserad på magnetiska atomkärnor.
  • Resonans påverkas av atomernas omgivning.
  • Typer:
    • 1D NMR – veckningsinformation
    • NOESY – avstånd mellan protoner (<5 Å)
  • Begränsning: protein <50 kDa
  • Resultat: ensemble av möjliga strukturer.

Röntgenkristallografi

  • Proteinet kristalliseras.
  • Kristall bestrålas med röntgen → diffraktionsmönster samlas.
  • Matematiskt → elektrondensitetskarta → modell av struktur.
  • Hög upplösning ger mer detaljer.

Kryo-EM

  • Direkt visualisering av frys-införda molekyler.
  • Kräver inga kristaller eller isotoper.
  • Single-particle-analys möjlig.
  • Snabb metodutveckling → dominerande teknik idag.
  • Upplösning beror på proteinets storlek.
  • Nobelpris 2017.

Kryo-EM – procedur

  • Protein fryses på grid i flytande helium.
  • Exponeras för elektronstråle i vakuum.
  • Många 2D-bilder sammanställs → 3D-struktur.