Kontroll av genuttryck i prokaryoter Claes Gustafsson Ribonukleotidreduktas (RNR) Deoxiribonukleotider (dNTP) bildas från ribonukleotider (NTP). Detta sker genom att NTP reducerars, d.v.s. förlorar sin OH-grupp i 2’-position. Denna reaktion katalyseras av enyzmet ribonukleotidreduktas (RNR) – finns både hos prokaryoter och eukaryoter. VAD ÄR EN GEN? En nukleotidsekvens i DNA, som krävs för syntesen av ett fungerande protein eller en RNA-molekyl (inkl. tRNA, rRNA etc.) I genen ingår även de reglersekvenser som bestämmer när och hur mycket av genen som skall tillverkas. 3 Olika gener uttrycks olika mycket ”Housekeeping genes” är gener som alltid är påslagna och som behövs för att en cell skall fungera normalt. TranskriptionsinitieringKodande sträng och mall-sträng Båda strängarna i DNA kan används som mall-sträng för RNA syntes. Vilken sträng i DNA som skrivs av till RNA bestäms av den riktning som RNA-polymeraset rör sig RNA syntetiseras alltid i 5’ till 3’ riktning. Om man inte vet riktningen som RNA- polymeraset rör sig så kan man inte veta vilken sträng som är mall-sträng 8 Promotorn bestämmer i vilken riktning RNA- polymeraset skall transkribera! En transkriptionsenhet är den sekvens i DNA som transkriberas till RNA. Startar vid promotorn och slutar vid terminatorn. Hos bakterier kan en transkriptionsenhet bestå av flera gener Man brukar kalla en sådan enhet för ett ”operon” Det bildas ett långt mRNA som kodar för flera olika proteiner. Gener ger upphov till proteiner involverade i samma metabola ”pathway” återfinns i samma operon! I ett bakteriellt mRNA från ett operon finns många startplatser för translation! Vid AUG som skall användas för initiering finns speciella sekvenser i mRNA – s.k. Shine-Dalgarno sekvenser, som hjälper ribosomen att hitta rätt. Hur hittar bakteriellt RNA- polymeraset till promotorn? 12 E. coli RNA polymeras (beta) är den katalytiska subenheten dvs. den som syntetiserar RNA i 5’ till 3’ riktning (sigma) styr enzymet till promotorn (känner igen en särskild DNA-sekvens!) Sigma subenheten hjälper RNA-polymeraset att hitta till promotorn och påverkar enzymets allmänna egenskaper ’ Kärnenzymet (saknar sigma) + Innehåller alla de subenheter av RNA- polymeras om behövs för syntes av RNA. Binder starkt till icke-specifikt DNA. Har mycket svårt att hitta promotorer. 14 ’ Holoenzymet (innehåller sigma) Kan hitta och specifikt binda till en promotor . Binder svagt till icke-specifikt DNA – kräver promotor- sekvens för att “fastna”. Hittar promotorn 10,000 gånger snabbare än kärnenzymet. Bakteriellt RNA-polymeras glider längs DNA och letar efter en promotor. 16 Efter initiering släpper sigma-faktorn och RNA- polymeraset fortsätter på egen hand. Det finns sju olika sigma-subenheter som reglerar olika typer av gener Gör det möjligt för bakterien att reglera uttryck av gener – kan välja att slå på eller av olika kombinationer av gener, beroende på situationen. Det finns särskilda sigma faktorer för snabb tillväxt, för att skydda mot värme- shock, för att stimulera rörelse etc. Aktivatorer och repressorer Nära promotorn finns bindningsplatser för proteiner som kan stimulera (aktivatorer) och stänga av (repressorer) transkription av alla dessa gener. 1819 I ett typiskt operon återfinns en ”operator”. Detta är en DNA-sekvens till vilken en repressor kan binda för att blockera initiering av transkription. Tryptofan-operonet - kodar för genprodukter som behövs för att bilda tryptofan Tryptofan-operonet kodar för genprodukter (enzymer) som behövs för att bilda aminosyran tryptofan Finns det lite tryptofan i omgivningen så behöver operonet uttryckas. Trp repressorn kan inte binda till operatorn och blockera transkription Finns det mycket tryptofan i omgivningen så behöver inte dessa enzymer uttryckas. Trp repressorn binder till operator-sekensen och blockerar transkription Inaktiv repressor Aktiv repressor När E coli har god tillgång på tryptofan i mediet, binder det till repressorn och orsakar en konformationsförändring så att repressorn kan binda till operatorn. Tryptofan fungerar som behövs för att repressorn skall vara aktiv! Tillgången på tryptofan reglerar tryptofanrepressorns aktivitet! Lac-operonet - kodar för genprodukter som behövs för att bryta ner laktos Glukos är förstahandsvalet som energikälla i bakterier. När det finns mycket glukos i cellerna är alternativa sockerkällor avstängda så att cellen huvudsakligen förbränner glukos. När det finns lite glukos i cellen kan arabinos, laktos eller andra sockermolekyler användas som energikällor. Förklarar varför Lac-operonet i normalfallet är avstängt! Vill endast slås på när glukos saknas! Och endast i de fall det finns laktos att tillgå! 26 Vid reglering av Lac-operonet samverkar en aktivator och en repressor CAP är en aktivator Två krav för transkription av Lac-operonet! 1. Ingen repressor bunden till operatorn! 2. Ett aktivatorprotein (CAP) som stimulerar initiering av transkription! Underlättar inbindning av RNA-polymeras. Kan öka transkriptionsnivån mer än 1000 gånger. Vissa aktivatorer behöver en mindre molekyl, en så kallad co-aktivator som binder till aktivatorn för att den skall vara aktiv. 28 Aktivatorer stimulerar transkription Co-activator I närvaro av laktos så bildas allolaktos. Binder till repressorn och får den att släppa operatorn. Observera skillnaden till trp- operonet! Lac-repressorn släpper operatorn när laktos finns närvarande i mediet. På det viset blockerar den inte längre transkription. (vid trp-operonet fick tryptofan repressorn att binda!). Hur regleras aktiviteten hos aktivatorn, d.v.s. proteinet CAP? I frånvaro av glukos så bildas molekylen cAMP. Binder till CAP, vilket får proteinet att fungera som en aktivator. Cykliskt adenosinmonofosfat “cAMP” – signalmolekyl med många funktioner! Aktivatorer och repressorer samverkar för att få reglerat genuttryck! Hur kan aktivatorn (CAP) samverka med repressorn för att få reglerat genuttryck från lac-operonet? I närvaro av glukos används inte lac-operonet. Även om laktos finns i omgivningen! Glukos är alltid bakteriens förstahandsval!! I frånvaro av glukos slås lac-operonet på! Men bara om det finns laktos i omgivningen! Antibiotika • För biologer är det ämnen som producerats av levande organismer i syfte att hålla andra organismer borta. • Inom medicinen kan dessa medel användas för att. behandla infektioner, men också vid cancersjukdom. Rifampicin binder till beta-subenheten i det bakteriella RNA polymeraset och blockerar elongering. Används t.ex. vid behandling av tuberkulos Principer för antibiotikas effekt – två exempel 1. Blockera initiering av transkription Principer för antibiotikas effekt – två exempel 2. Interkalation Actinomycin lägger sig mellan basparen i DNA. “interkalation” Stör t.ex. Transkription och DNA replikation Används vid cancerbehandling t.ex. ovarialcancer Det finns speciella virus som bara infekterar bakterier – Bakteriofager Bakteriofager infekterar bakterien och utnyttjar cellen för att skapa många nya kopior – bakterien dödas i en s.k. lytisk cykel Bakteriofag T7 RNA-polymeras används i ren form för att producera mRNA-vacciner mot t.ex. COVID.